一、引言

蛋白质翻译后修饰(PTM)在细胞生物调节中发挥着基本作用。PTM是mRNA翻译后蛋白质的酶促共价化学修饰。蛋白质化学修饰非常重要，因为它们会潜在地改变蛋白质的物理或化学性质、组成、活性、细胞定位或稳定性。实际上，在氨基酸或蛋白质的N端或C端加入或移除化学基团会导致大部分蛋白质发生变化。一些PTM可以被动态地添加或移除，这是一种可逆的蛋白质功能调控机制。目前超过400个特定的蛋白质修饰已被鉴定，也许还有更多的修饰类型有待发现(CreasyandCottrell,2004)。迄今为止最常见的PTM有磷酸化、苏素化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、硫酸化、糖基化及酰基化(表40.1)。

DNA和组蛋白组成了核小体,而核小体捆绑在一起组成了染色质丝(chromatinfiber)。组蛋白密码(histonecode)假设染色质-DNA的相互作用是通过组蛋白上多种PTM协同调节的(JenuweinandAllis，2001;StrahlandAllis，2000)。组蛋白质上赖氣酸的乙醜化最先被报道，并且与基因转录活性相关(Rothetal.,2001)。组蛋白尾部的甲基化、乙酰化、ADP-核
糖基化、泛素化和磷酸化等修饰协同调节特定基因的表达程序(GoddeandUra,2008)。

磷酸化修饰，最普遍的PTM之一，是许多生化学家的研究主题。目前估计30%的人类蛋白质都发生了磷酸化(Cohen,2001;HubbardandCoherul”3)。例如，胰岛素/胰岛素样生长因子-KIGF-1)信号通路中，酪氨酸激酶和磷酸酶将信号从细胞表面的配体-结合受体转导至下游耙标(Taniguchietal.，2006)。

传统的检测蛋白质PTM的方法包括Edman降解法和薄层色谱法(thin-layerchromatography,TLC)。然而这些方法会有一些限制。例如，需要大量起始材料,并且对于鉴定罕见的或亚化学计量的PTM无能为力。由于大多数PTM都会导致与之对应的被修饰蛋白质的质量改变,因此，能够检测蛋白质分子质量改变的方法，即基于质谱的蛋白质组学，目前已普遍用于鉴定PTM。一些PTM，如磷酸化和甲基化,会增加蛋白质的质量，然而另外一些PTM，像信号肽的去除或二硫键形成，则使蛋白质的质量减少。依赖于所使用的质谱设备,本章所介绍的蛋白质组学方法具有髙灵敏度优势，能够以小于百万分
之一（<1ppm，partpermillion)的精确度测量分子质量（Makarovetal.,2006;Luetal.，2008;ScigelovaandMakarov,2006)。设备制造商和理论研究者一直致力于提升仪器技术以及发展新的PTM鉴定方法（Garciaetal.，2005;2007)，如近期这一领域内的研究进展包括，断裂肽段（fragmentationofpeptide)的电子转移解离法（electrontransfer
dissociation,ETD)和能够精确测量未消化蛋白质质量的动态检测器（Coonetal.,2004;Mikeshetal.，2006;Pitterietal.，2005;Sykaetal.，2004)。

能够选择性分离可能发生PTM的蛋白质或多肽的富集方法可以与基于质谱的蛋白质组学方法联用。这些富集手段可以减少罕见修饰所带来的问题。可将众多可用的亲和富集策略主要分为两类:第一类是用抗体识别一个特定PTM或者带有特定修饰的肽段,如抗磷酸化酪氨酸的抗体可用于富集含有磷酸化酪氨酸残基的肽段（Blag0evetal.，2004;RushetaL，2005!Zhangetal.，2005);第二类方法基于固定化树脂对某种修饰的化学亲和作用，包括针对磷酸化的固定化金属亲和色谱法（IMAC)和针对糖基化的凝集素色谱法(Itoetal.，2009)，这些方法已经广泛使用并仍在发展之中。

另外一个能够有效鉴定PTM并应用普遍的蛋白质组学方法是二维凝胶电泳（twodimensionalgelelectrophoresis，2I>GE)。PTM能够改变蛋白质的等电点及其在2D凝胶中的电泳迁移率。如果通过2D凝胶电泳发现了不同细胞种类或生长条件之间的这种改变，就可以将该蛋白质分离出来，并通过测序鉴定它的PTM。例如,一个蛋白质不同的磷酸化将改变它的等电点，并且可能会导致电荷异质性。这种发生不同磷酸化的蛋白质会表现为一串具有不同的等电点但是相似的分子质量的2D斑点。这种形式有时被形象的比喻为「项链上的一串珍珠」。多年来已经发明了许多揭示蛋白质PTM的特定蛋白质染色方法(Geetal.，20〇4;Patton,2002)，包括直接检测胶中磷蛋白和糖蛋白的荧光方法（Geetal.,2004;Steinbergetal.，2001;Schulenbergetal.，2003a,b,2004)。对于这些2D斑点，蛋白质可被胶内消化，然后回收的肽段通过质谱分析，以鉴定、验证并绘制可能的PTM图谱（Hayduketal.，2004;SteinbergetaL,2003)。然而用2D凝胶电泳法鉴定PTM并非易事，因为修饰肽段的回收和分析常常会出现很多问题。

蛋白质组学已有多种工具来量化蛋白质及其特定PTM的绝对丰度或中度相对丰度(PaolettiandWashburn,2006)。目前已经发展多种体内和体外标记方法，可利用质谱定量PTM，并精确测量细胞事件中PTM的变化（Goodlettetal.,2001;Gygietal.，1999;Odaetal.，1999;Ongetal.,2002;Rossetal.,2004;Zhangetal.，2005)。PTM的定量对于研究某一特定PTM的生物学意义有着至关重要的作用，这是因为简单的鉴定一个修饰的存在与否，有时并不足以提供足够的生物学信息来说明它的重要性。MatthiesMann及其同事的一项研究发现,HeLa细胞中14%已鉴定的磷酸化位点,在表皮
生长因子的刺激下增加了至少2倍,这说明了PTM定量的重要性(Olsenetal.，2006)。

然而，在使用基于质谱的蛋白质组学来鉴定PTM时,需考虑到某些局限性。某些PTM，如丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸的磷酸化，以及O-糖基化或]V-糖基化是不稳定的，因此在样品制备过程中维持这些修饰比较困难。而且如果没有采用有效的分离方法,未修饰肽段或蛋白质会影响质谱分析。当样品中大部分蛋白质分子都未被修饰时，PTM亚化学计量的检测将会异常艰难。对于质谱分析，有不同厂家的众多仪器可供选择，它们均有各自的优点和缺陷。通常的方法是将蛋白质消化为肽段，进而直接分析肽段。一个给定肽段的修饰将会降低离子化效率，从而会影响质量谱图，并阻碍序列鉴定。另外，由于许多肽段包含众多潜在PTM的氨基酸修饰位点，因此有时很难判断到底是哪一个氨基酸发生了修饰。除此之外，当使用碰撞诱导解离（collisioninduceddissociation，CID)来断裂含不稳定PTM(如磷酸化和糖基化)的肽段时，不稳定的基团将会发生消除反应，从而产生中性丢失碎片（neutrallossfragment)。这个反应在能量上比酰胺键断裂更有利。如此产生的质量谱图通常不能得到足够的测序离子，因而无法准确鉴定肽段或者被修饰的氨基酸。最后，稀有PTM的检测非常有挑战性,它的鉴定通常需要非常高灵敏度的质谱手段或者PTM富集策略。

对于使用任何一种质谱方法得到的蛋白质组学数据,需要格外关注所获得信息的丰度和复杂程度。典型的，在液相色谱和串联质谱联用分析消化蛋白质的异质混合物时，能够产生成百上千万的谱图。在所获得的质谱图中，对于观测到的峰有近乎无穷的PTM和相应加合肽的可能组合。大量的数据需要一种「insilico」蛋白质数据库检索算法，从而将基因组数据库得到的理论谱与实验所得到的观测谱相匹配。搜索实验谱鉴定PTM时需要了解一些潜在修饰特性的「先验」知识，这是因为搜索时由于计算资源有限而限制了可以纳人考虑的修饰数量。例如，当仅考虑丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)的磷酸化时(这种磷酸化增加80Da标称质量），所需的计算资源，比起搜索同样的数据集但是没有质量漂移的情况要高出指数数量级。这种情况的发生是由于算法不仅需要考虑没有任何修饰的肽段，还不得不考虑当蛋白质序列中S、T、Y残基发生修饰或未发生修饰的所有情况。为解决这个问题，许多团队一直致力于发展算法软件，用来从质谱数据中鉴定未能预料的PTM(Chalkleyetal.,2008;Hansenetal.，2001，2005;Tangetal.，2005)。这些算法可以计算推测的肽段序列和实验MS/MS前体间的质量差异，并将质量漂移定位到肽段的序列位置（Hansenetal.，2005)。

本章主要针对研究最频繁的一些修饰，着重介绍质谱和蛋白质组学领域的现存和新出现的鉴定PTM的技术方法，但这些方法的应用并不仅限于本章所介绍的内容。我们也会与讨论修饰类型一样，对于串联质谱法中可用的技术做一概述，这些技术会影响实验者鉴定特定PTM的能力。前期对于PTM的整体分析研究凸显了各种各样的困难—这些困难来自于从大规模筛选所得到的大批数据中分辨可用信息。本章会给出一个工作流程示例，来帮助研究者发展最适用于研究他们当前关心的问题和可用资源的方法。除此之外，我们将概述许多可用方法来进一步定量PTM。很明显，可供研究者选择的资源和技术越来越多，这些资源和技术中很多都不仅仅可用来鉴定PTM。

二、用于鉴定PTM的富集技术

2.1磷酸化

丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的可逆磷酸化也许是研究最为深人的PTM。蛋白质磷酸化信号网络介导细胞对与不同的应激因子、生长因子、细胞因子以及细胞间相互作用作出响应。憐酸化还影响多种细胞进程，如增殖、凋亡、迁移、转录和蛋白质翻译（White，2008)。在肿瘤、自身免疫疾病、代谢紊乱和传染性疾病中都涉及蛋白激酶和磷酸酶的异常调节（Blume-JensenandHunter，2001;GatzkaandWalsh，2007;Sirardetal.，2007;TaniguchietaL,2006)。一个磷酸化反应事件就会对细胞进程产生剧烈影响。例如,养分剥夺、环境应激、某些小RNA病毒感染都会激发eIF4E-结合蛋白的去磷酸化，进而导致eIF4E-结合活性显著提高,从而抑制翻译(Gingrasetal.,2001)。

传统的鉴定磷酸化位点的手段包括使用32P-标记的ATP(32P-IabeledATP)或磷酸共培养细胞。磷酸化蛋白质组会摄取生长培养基中的放射性磷,继而通过一些手段，如2I>GE或高效液相色谱(HPLC)检测具有放射性的蛋白质。分离得到的蛋白质会被水解。所得的磷酸肽在TLC板中分离，随后利用Edman降解法进行测序。然而，这些方法非常费时，并需要大量相对纯的磷酸肽，而且必需使用大量放射性材料(McLachlinandChait，2001)。

由于以上缺陷，基于质谱的蛋白质组学迅速崛起，成为鉴定磷酸化的首选方法。近期—个蛋白质组研究通过比较大肠杆菌co「）、乳酸菌

质谱法能够从复杂的蛋白质混合物中鉴定出特定的磷酸化位点，但是这种方法也确实会有一些问题，如在样品量有限、样品复杂度高或样品中蛋白质浓度动态范围广的蛋白质组学应用中时(White,2008)。而将这些困难更为复杂化的是，磷酸化通常是亚化学计量的，因此一个蛋白质来源的磷酸肽的浓度比其他肽段的浓度都要低。大量未修饰肽段抑制了质谱对憐fe肤的反应。.这个现象会导致目的憐酸肤检测信号的缺失（McLachlinandChak,2001)。这可以通过多种富集技术减少与PTM变体相关的未修饰肽段含量，从而减少这种抑制性假象(suppressionartifact)。

其中一种应用于憐酸化鉴定的帛集技术是使用强阳离子交换（strongcationexchange,SCX)树脂来选择性分离磷酸肽。研究发现,在pH小于2.6时，胰蛋白酶消化的磷酸肽不能被SCX颗粒保留（BeausoleiletaL,2004)，这可能是由于磷酸基团荷载了更多的负电特性。SCX柱的流穿液可以用反相(RP)色谱柱分离，并用质谱分析(LimandKassel，2006)。这种将磷酸肽从未修饰的相似物中分离出来的方法,可以帮助减轻上述的质谱检测中的抑制问题。这种富集技术的优势在于既能在线（on—line)也能离线（offline)分离。而劣势之一是它依赖于SCX树脂与磷酸肽的不可结合性，这点与其他一些通过与磷酸化残基结合，并因而能够选择性地富集磷酸肽的方法不同。

固定化金属亲和层析(IMAC)是一种运用最为普遍的从复杂的消化蛋白质混合物中选择性分离磷酸肽的方法。这种方法通常利用一种金属螯合介质来结合三价金属离子，如Fe34或Ga3+(Sykoraetal.，2007)。这种带电树脂结合磷酸肽后,先用洗涤液(通常是乙酸溶液)去除未修饰肽段，接下来可用磷酸盐缓冲液或者高pH溶液洗脱磷酸肽。洗脱
的磷酸肽可直接过RP柱脱盐用于下一步质谱分析，也可离线进行进一步富集或其他操作。然而，IMAC法确实存在一些复杂因素。如果携带多磷酸化位点的磷酸肽丰度较大，它们会覆盖IMAC树脂，导致单磷酸化或双磷酸化的磷脂肽保留较少。并且,其他酸性肽段也会与IMAC柱发生亲和作用,从而与鱗酸肽一起被富集。这一问题在应用于极度复杂的肽混合物(如全细胞提取物)时会更加严重。为了避免该问题,许多研究者试图通
过化学还原反应来甲基酯化酸性残基和C端(Ficarroetal.，2002)。然而，研究发现甲基酯化反应并不是定量的（Cirullietal.，2008)。这样，目的肽段的存在形式将是修饰过、部分修饰或未修饰3种。这增加了混合物的复杂程度,给定肽段的相对量实际上减少了（Cirullietal.，2008)。

另外一种类似于IMAC法的方法，使用二氧化钛(TiO2)作为金属螯合树脂的替代物(Larsenetal.，2005;Pinkseetal.，2004;Thingholmetal.，2006)。正如IMAC法中修饰肽段的磷酸基团与H价金属有亲和力一样，在酸性条件下磷酸基团同样与二氧化钛分子有亲和作用（Larsenetal.，2〇05;Pinkseetal.，2004;Thingholmetal.，2006)。通过转换到高PH缓冲液中，磷酸肽可以从TiO2基质中洗脱下来。这种方法的优点在于，柱制备时间短，比IMAX树脂洗涤循环数少。研究表明,尽管这两种方法使用同样的亲和原理，但是它们却具有互补性—两种方法分别能够检测到不同磷酸肽（Cantiriet
al.，2007)。IMAC的特点是针对多磷酸化位点的肽段具备高亲和力，而二氧化钛则优先结合单憐酸化多肽(Bodenmiller，etal.，2007)。这表明在一个研究中同时使用两种方法能够最大限度覆盖憐酸化蛋白质组。

另外一类磷酸肽富集方法则利用化学方法在磷酸化位点引入亲和标签（Gosheetal.，2001;Odaetal.，2001)。该方法利用碱性环境，通过卩-消除反应从磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基中去除H3PO4(McLachlinandChait，2003;Odaetal.，2001);进而通过
Michael-like加成反应，将一个二巯基化物加到双键上;接着用结合了生物素的烷化试剂处理巯基，得到的生物素化肽段可利用亲和素柱色谱来富集（图40.1)(McLachlinandChait，2003)。这个方法的一个难点在于，由于生物素与亲和素间的高亲和力，回收标签化的肽段成为问题。并且，这个方法能够富集磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸，却无法富集磷酸酪氨酸。片消除反应后接michael加成反应同样会改变O联片JV-乙酰葡糖胺（O-

GlcNAc)修饰，这样会与磷酸化竞争富集作用(Wellsetal.，2002)。最后，在,消除反应的碱性环境下，会发生不需要的副反应，导致对肽段质量造成无法预料的影响，从而使下游的肽段质谱鉴定变得更加困难。

在质谱过程中，必须考虑磷蛋白的特定化学性质。发生在S或T氨基酸上的磷酸化是不稳定的。传统的断裂方法会导致磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸残基发生H3PO4,或HPO3选择性中性丢失，并且先于肽键的断裂绝大部分憐酸化修饰都发生了片消除反应，仅有一小部分憐酸化修饰伴随着肽链断裂而保留下来（Bennettetal.,2002;Leeetal.，2001;Maetal.，2001)。这会造成质量谱图中包含的测序离子变少，而且通常这些离子强度会变弱。最终较低的信噪比（图40.2)会妨碍对肽段序列的解释。尽管磷酸酪氨酸也可能丢失磷酸基团，但是很少像磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基一样产生强烈的中性丢失离子。一些质谱仪使用ETD避免这种中性丢失问题，产生的谱图既适合于序列分析也适合于憐酸化残基测定。我们在介绍用于蛋白质组学鉴定PTM的设备时，将会进一步讨论这种断裂方法。

另外，中性丢失伪迹(neutrallossartifact)也可为研究人员提供便利。中性丢失迹象是肽段中含有磷酸化位点的一个显著的指示信号。质谱中观察到的中性丢失峰通常由于其形成的优先性而具有高强度。因此，如果对于+1价电荷肽段，发现前体离子丢失98m/z(H3P4)或80m/z(HP03)，可以推断在肽段序列中存在一个磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基。现代质谱仪可以监测这种质量丢失。离子阱质谱仪能够分离中性丢失碎片，并开始另一轮断裂（MS3scan)(Beausoleiletal.，2004;Gruhleretal.，2005;OlsenandMann，2004;Ulintzetal.，2009)。这个附加分析步骤的结果就是提供了额外的序列覆盖范围，从而帮助鉴定磷酸肽，并将PTM匹配到特定氨基酸。另外一种MS3¾描的替代方法就是运用于离子阱质谱仪的磷酸肽断裂「PseudoMS」」或称多级活化（MSA)(SChroederetal.，2004)。这种方法在MS/MS扫描肽段产生的中性丢失产物引入了CID。中性丢失离子产生的离子与初始MS/MS产物离子一起被捕获得到复合谱。在MSA中，中性丢失离子被转变成一些结构上有益的碎片离子，这种离子在数据库搜索算法中的分数将会出现升高现象(Schroederetal.，2004;Ulintzetal.，2009)。

磷酸化给肽段引入一个负电荷，这也将影响质谱的分析。当阳离子模式下操作时，这个负电荷会减弱质谱仪响应(McLachlinandChait，2001)，这会导致谱图质量变差，并使磷酸肽鉴定更加困难。而且，增加的负电荷会降低质谱分析前蛋白质混合物制备时的蛋白质水解作用。然而需要说明的一点是，HarnioSteen与同事发现,在使用电喷雾电离(electrosprayionization,ESI)选择性研究磷酸肽时,没有证据能证明电离程度/探测效率会降低（Steenetal.，2006)。

作为一种替代方法，SteveCarr和同事提出了前体离子扫描(precursorionscanning)技术，可以用来避免阳离子模式运行质谱时产生的一些问题(Carretal.，1996)。串联质谱是在阴离子模式下运行，并且磷酸化残基会产生特征性的碎片:PO3—大小为一79Da，PO2—大小为一63Da。当在前体离子扫描中发现以上事件中任何一个时，将会对前体离子进行MS/MS检测（ZappacostaetaL，2006)。这种方法检测磷酸肽时比阳离子模式质谱灵敏度更高(CarretaL，1M6)。然而，阴离子谱解释较为困难，因此并未得到广泛

2.2糖基化

糖基化是一种常见的PTM,并且已经证明能够影响酶的活性、蛋白质定位、稳定性、信号转导、细胞黏附和蛋白质相互作用(Spiro,2002k目前已经发现在肿瘤恶性转化和肿瘤发生时，生物体液中蛋白质和细胞表面的糖基化模式会发生变化(DurandandSeta,2000)。一个蛋白质组中存在着大量糖基化修饰。O-糖基化蛋白质是在丝氨酸和苏氨酸位点发生修饰,而C-糖基化则靶向于色氨酸,N-糖基化靶向天冬酰胺。发生N-糖基化的蛋白质会有一些共同之处，如核心结构、一些去除N联结构的酶，并且普遍分布在细胞膜胞外区域（Medzihradszky,2005)。N-糖基化位点有一个确定的共有序列（consensussequence),即N-X-S/T,X是除脯氨酸之夕卜的任何氨基酸(PlessandLennarz,1977)。另—个靶向丝氨酸和苏氨酸残基的修饰是O联β-N-乙酰葡糖胺(OGkNAc)。GeraldHart和同事开创了这种动态核质（nucleocytoplasmic)PTM研究的先河（HoltandHart,1986)。发生这种修饰的许多靶向蛋白质也能够发生磷酸化修饰，推测这种修饰对蛋白质磷酸化修饰会有拮抗作用(AhmadetaL,2006)。

质谱鉴定磷酸化的一些问题同样也出现在糖基化研究中。相对未被修饰的蛋白质，这些修饰在丰度上都倾向于亚化学计量。蛋白质糖基化和OGlcNAc修饰在质谱中都是不稳定的，通常产生低质量的测序谱图。尽管N-糖基化的一种共有序列已经非常明确，然而在体内仅有部分含有这一共有序列的蛋白质发生了糖基化。

上面提到的可应用于磷酸化分析的替代的肽段断裂方法同样适用于糖基化。能够解决糖基化低丰度问题的富集技术也已存在(MechrefetaL，2008)。使用凝集素亲和层析(lectinaffinitychromatography)可选择性地富集糖蛋白。凝集素是一种高度特异的糖结合蛋白，并能够与固相基质偶联.偶联好的树脂与复杂的水解蛋白质混合物混合，通过洗涤、洗脱即可分离到适用于蛋白质组学分析的糖肽组分。OGlcNAc可用P-消除法及后续的Michael加成二硫苏糖醇或生物素-戊胺(biotinpentylamine)反应来富集，这种方法类似于前文磷酸化中所详述的内容(Wellsetal.，2002)。另一种方法是N-联糖肽固相提取法（solid-phaseextractionofN-Iinkedglycopeptides，SPEG),这种方法使用肼化学法(hydrazinechemistry)直接将糖肽添加到固相支架上(Tianetal.，2007)。洗漆后，用肽-N-糖苷酶(peptide-iV-glycosidase)处理来洗脱糖肽。凝集素亲和层析色谱法的优点在于，能够结合的糖蛋白范围非常广,通过不同糖苷酶洗脱能够有效分离不同类型的糖肽(YangandHancock,2005)。也有专门的柱子，所包含的凝集素特异地结合一定类型的糖连接结构，能提供更高不同程度的选择性富集（Tianetal.,2007)。需要说明的是,使用糖苷酶诜脱糖肽是从肽段上切下寡糖，这使得原本可以通过质谱获得的结构信息丢失。但是这却大大简化了数据分析过程,因为糖基化的天然结构非常复杂，并且以多变的聚糖基化(polyglycosylated)形式存在。

2.3泛素化和苏素化修饰

泛素是一个由76个氨基酸组成的蛋白质，能够通过其C端的甘氨酸残基结合于底物赖氨酸的α氨基基团。这个过程需要E1、E2、E3酶共同参与（FangandWeissman,2004)。泛素的序列含有7个赖氨酸,这7个赖氨酸能够被泛素化选择，从而形成泛素链(FangandWeissman，2004)。被进一步泛素化的泛素分子内部的赖氨酸能够决定泛素化修饰的生物学意义。例如，K48连接的泛素链能引导被修饰蛋白质经由26S蛋白酶体降解,而K63的连接形式则参与到DNA损伤反应、蛋白质运输、NF-KB信号通路的信号转导等过程(IkedaandDikic，2008;PickartandFushman，2004)。泛素化蛋白的周转非常迅速，这导致这种PTM处于低稳态水平(Pengetal.，2003)。而使泛素化位点的预测更加复杂化的是,几乎没有数据能够证明泛素化存在一个通用基序(SUteretal.,2008)。

另一个类似泛素的小蛋白质分子就是苏素化修饰蛋白（SUMO)。尽管两种蛋白质一致性仅18%,但是它们的三维结构却有相似性(Bayeretal.，1998)。苏素化修饰和泛素化共享相同的E1、E2、E3酶,将SUMO分子结合到一个保守基序内部的氨基酸残基上。苏素化修饰优先发生在女K-X-E序列中，^代表一个疏水性氨基酸（Rodriguezetal.，2001)。苏素化修饰靶向于大量参与各种不同细胞进程的蛋白质,如转录调节、核小体形成、细胞核孔复合物和DNA修复(MelchioretaL，2003)。苏素化修饰能够与泛素化竞争，从而阻止蛋白质被降解,稳定细胞所需的关键的酶。这种修饰还能够将蛋白质进行特定的细胞定位,如核孔复合体(Manzaetal.，2004)。

目前已经发展了一些有效的富集方法来分离泛素化和其他苏素化修饰的蛋白质。其中最成功的一种是在泛素及类泛素分子的基因序列中整合人氨基末端表位标签（aminoterminalepitopetagKPengetal.，2003;Tagwerkeretal.，2006)。目前已成功使用了多组氨酸标签，以及由多组氨酸标签和FLAG标签组成的串联亲和标签(Chang,2006)。串联亲和标签纯化方法能够减少假阳性的出现率，但是无法完全消除。使用抗泛素类分子的抗体是一种选择,但是这种抗体应用于免疫沉淀中以分离泛素蛋白质的方法仍在发展中。也可利用泛素结合蛋白质以避免一些由抗体和亲和标签引起的问题(Kirkpatricketal.，2005)。表位标签在简单模式系统，如酿酒酵母(Sacc/iarom^ycescereTO’hae)中应用非常方便，因为编码未标签泛素的多个基因可被删除，使得细胞中仅有含表位标签的泛素分子。

事实上，泛素化和苏素化修饰都是蛋白质类PTM,可采用多种质谱的手段鉴定靶蛋白。当胰酶消化泛素化蛋白质时，部分泛素分子被切割下来。剩下胰蛋白酶消化片段的泛素化位点上含有2个甘氨酸残基，通过一个异肽键与赖氨酸相连（PengetaL，2003)。这一肽段导致在赖氨酸残基处产生了一个114Da的标称质量漂移，而且由于胰蛋白酶不能识别修饰过的赖氨酸，因而还丢失了一个胰蛋白酶酶切位点。对于其他苏素化修饰也有各自特征性的质量漂移,见表40.2(Denis〇netal.，2005)。当搜索谱图寻找该类型的潜在PTM时，可以考虑这些特性。

使用基于质谱的蛋白质组学方法研究此类PTM的一个显而易见的问题就是质量S移(massshift)的冗余，如表40.2所示。从一个肽的鉴定谱图中可能无法分辨这是泛素化修饰还是苏素化修饰，因为这两种类型都能在赖氨酸残基处增加114Da。苏素化修饰会使肽段质量增加较大，这会影响肽段的电离，减弱电离效率。发生苏素化修饰肽段会使结果谱图变复杂，甚至无法解读。一个实验室发展了苏素化修饰模式识别软件（SUM-m〇n)，来寻找由复杂PTM产生的碎片离子模式，并鉴定修饰肽段及其相应的修饰位点

三、蛋白质的硝化修饰

酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸侧链的硝化与亚硝化作用构成了蛋白质硝化PTM的主要部分。这些加成反应由发育、氧化应激及衰老过程中产生的活性氮介导。活性氮的增加是由一氧化氮和活性氧的过度反应或调控紊乱造成的（Yeoetal.，2008)。活性氮和活性氧能够靶向于DNA、脂类和蛋白质(Barnesetal.，2003)。根据产生的自由基，活性氮将会优先与酪氨酸残基反应，形成3-硝基酪氨酸或3-亚硝基酪氨酸(Beckmanetal.，19如酪氨酸的硝化修饰的特性也许可通过产生的加合物得到最好的描
述。研究表明，酪氨酸硝化水平的增加与衰老相关的神经退行性疾病有关，而且可以作为氧化应激的一个生物标志物(Yeoetal.，2008)。在正常生理条件下，硝化酪氨酸加合物的形成会被存在的还原剂,如谷胱甘肽阻止(Chenetal.,2004)。酪氨酸硝化会将结合的羟基的PKa从10.1改变至7.2,并导致被修饰蛋白质结构和功能上的改变(Sokolovskyetal.,1967)

目前没有能够直接分离硝化多肽和蛋白质的选择性富集策略。这可能是由于这种PTM的一氧化氮基团的化学活性较低。在有连二亚硫酸钠（dithionite，DTH)存在的还原环境中，这些相对惰性的部分可被转换成胺类,从而易于与标签基团反应（Yeoetal.，2008)。随后，标签化的多肽可通过蛋白质组学方法选择性分离和分析。目前应用最普遍的鉴定蛋白质硝化修饰的方法，是将2I>GE与某一给定的硝化加合物的特异性抗体的免疫印迹分析结合(ZhanandDesiderio,2004)。蛋白质通过2D——GE实验被解析，并通过适当抗体直观的观察到发生此种修饰的蛋白质。进而将免疫印迹阳性的斑点从胶上切离，消化后利用质谱进行鉴定(ZhanandDesiderio,2004)。对于酪氨酸硝化修饰，在搜索质谱数据鉴定加合位点时，可根据加合物的不同进行鉴别:硝化作用产生一个45Da的标称质量漂移，而亚硝化作用产生一个29Da的标称质量漂移。

四、甲基化和乙酰化

赖氨酸和精氨酸的甲基化修饰（+14Da)以及赖氨酸乙酰化修饰（+42Da)这两种PTM类型在组蛋白（histone)密码中的作用正在被详加分析(JenuweinandAllis,2001;StrahlandAUis，2000)。第一次发现与赖氨酸连接的乙酰基是在一项对组蛋白修饰的研究中(JenuweinandAIlis，2001)。组蛋白乙酰化水平增高通常与基因转录的局部激活有关(Zhangetal.，2002)。而组蛋白赖氨酸甲基化则集中于被抑制基因的启动子区域(Berger，2007)。研究发现，乙酰化是动态可逆的，而甲基化更稳定而且「长寿」（BernsteinandAllis，2005)。尽管大量研究都集中在这些组蛋白上的PTM，但甲基化和乙酰化修饰在许多蛋白质上都会发生（GlozaketaL，2005;GrewalandRice，2004;Sadoul
etaL,2008;YangandSeto,2008)。在真核生物中，N端乙酰化是最常见的PTM之一，大约85%真核蛋白都会发生（PolevodaandSherman,2000)。第一个发现的被乙酰化和去乙酰化调节的非组蛋白是p53蛋白（GuandRoeder,1997)。

与许多其他PTM—样，传统的鉴定甲基化和乙酰化的方法是利用能识别修饰的特异性抗体(antibody)。但是这个方法受限于免疫方法相关的交叉反应以及特异性问题。关于组蛋白，有一些从细胞核中选择性分离的方法(Garciaetal.，2007)。更通用的鉴定甲基化和乙酰化位点的方法是利用体外放射性标记分析。这一技术利用了乙酰基转移酶或甲基转移酶来催化加成放射性乙酰基或甲基供体。薄层色谱法(TLC)或HPLC分离之后进行微量测序，能够揭示放射性标记氨基酸(Sobeletal.,1994)。这种放射性标记方法有它的缺陷，它需要的纯的起始材料量非常高，并需要使用放射性检测修饰氨基酸。

目前没有一种有效的方法能够选择性富集甲基化或乙酰化修饰的肽段或蛋白质。另外，由于甲基化和乙酰化发生在碱性残基上，在利用胰酶作为蛋白酶时进行酶切的效率较低。尤其对于甲基化修饰这一问题更为严重，因为碱性残基可能在多个胺位点发生甲基化。要克服这个问题比较简单的选择就是使用另外的蛋白酶。然而，丢失的胰蛋白酶切位点也可能给研究者提供了帮助，它可以作为一个指示以说明该位点可能发生了修饰。串联质谱搜索算法能够考虑到乙酰化和甲基化修饰分别带来的42Da和14Da的平均质量漂移和28Da双甲基化质量漂移以及42Da的三甲基化质量漂移。由于三甲基化和乙酰化肽之间的质量漂移仅相差0.0363Da，因此在研究三甲基化时可能发生错读。利用一个质量精确度和分辨率足够高的质谱仪可以分辨这一质量差异（Zhangetal.,2004)。

另一个鉴定乙酰化和甲基化的诊断工具是分析CID类型质谱中产生的亚胺（immo-nium)离子。含有未修饰赖氨酸的肽段通常在8½¾‘处产生一个特征性的亚胺离子峰(TrelleandJensen,2007)。当赖氨酸发生修饰时,会形成一个不同的具有独特Wz值亚胺离子（图40.3)。受限于发生的重排反应（rearrangementreaction),无法形成双甲基或三甲基化形式的亚胺。然而，三甲基形式会产生一个独特的中性丢失碎片，与前体相比少了59Da,这是由于丢失了一个三甲胺(Zhangetal.，2004)。图40.3展示了发生的重排反应，以及不同亚胺离子及其相应的值。这些独特的鉴别特征仅能通过CID质产获得。

五、质谱分析

质谱仪器的多种设计和配置都支持蛋白质组的动态性质及其相关PTM的研究工作。对鉴定PTM而言，质谱仪的最重要的两个特征（feature)就是其质量准确度和分辨率。与蛋白质鉴定不同(其通常是基于鉴定同一蛋白质中的多个独立肽段)PTM必须通过单独的MS/MS谱图来鉴定。JohnYates及其研究团队发展了一些方法，利用不同酶独立消化产生的重叠肽段增加序列覆盖度，以减少绘制修饰图谱时的不确定性(MacCossetal.,2002;Wuetal.，2003)。尽管大量重复的肽段序列减少了不确定性,但是这一方法仍需要足够的起始材料以用于多次质谱分析。

由于PTM的鉴定及其在肽段上的定位通常依赖于单一的MS/MS谱，因此具备高质量准确度和分辨率的质谱仪有着明显的优势(Clauseretal.，1999;HaasetaL,2006;MannandKelleher,2008)。质谱设备因肽段电离、肽段断裂、离子分离和信号检测方法的不同而异。基于质谱的分析方法也通常与色谱分离技术联用以提高灵敏度，可帮助给定生物样品中的多肽检测及分离复杂的肽段混合物。正如前文所强调的，许多色谱法都可以富集目的PTM，从而提供了一种更有效的方法来鉴定复杂蛋白质或肽段混合物中的修饰作用。很明显，设备配置和分离技术的结合为研究者带来了令人眼花缭乱的可能性。本部分中,我们尝试讨论目前所用质谱的优点和可能的局限。

可能目前蛋白质组学中应用最普遍的质谱仪都采用电喷雾电离(ESI)将肽段引入气相，进而通过下游设备进行分析。这种类型的设备包括离子阱、三重四极杆、飞行时间(TOF)、四极杆飞行时间(q-TOF)、轨道阱(Makarov，2000)和傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)等。离子讲设备的优势在于快速扫描时间和高灵敏度，然而它们受限于质量精确度（士0.1〜IDa)和分辨率。在离子讲质谱(iontrapmassspectrometer)中，CID的机制不支持捕获质量小于前体质量28%的碎片。造成的直接后果就是丢失了1/3的MS/MS数据。这种局限性被称为CID碎片的「1/3法则」或「低质量截除」(cut-〇ff)。其他质谱仪，如q-TOF、三重四极杆、轨道阱及傅里叶变换设备则保留了低质量生成离子。低质量生成离子可能提示一些有关肽段的序列组成信息，这对从数据库中搜索到确定的PTM非常有用。

为解决有限的准确度和分辨率问题，可以将线性离子阱与轨道阱分析器结合起来，组成混合LTQ-轨道阱质谱。质量准确度可以提高至低ppm级(<5ppm),并且增加的分辨率能够分辨肽段的同位素包络(isotopicenvelope),因此可以确定前体肽的荷电状态。q-TOF是研究PTM的非常好的选择，因为它们使用的断裂方法利于保持不稳定的肽段修饰。这要归功于其高能量断裂方法，以及断裂发生的时间范围非常短。TOF质量分析器对于分析前体和碎片离子都具有高质量准确度和分辨率。对于串联质谱实验，TOF质谱分析器可以通过碰撞室分隔开(TOF-TOH产生常规的MS/MS谱(MedzihradszkyetaL，2000;VestalandCampbell,2005)。目前在可利用的质谱仪中，FT-ICR设备具备最高的准确度和分辨率。然而其高昂的价格对许多实验室来说是难以承受。除此之外，其低扫描率降低了设备的灵敏度，为获得一个可测的信号必须使用大量分析物。

一般来说，ESI是最适合鉴定酸性小肽的(Coveyetal.,1991)。ESI通常产生+2价或+3价电荷状态的胰蛋白酶消化的肽段，而MALDI技术通常产生一个+1价电荷状态的离子。这种复杂性使得质谱图的解释变得更加困难，除非该设备在分辨肽段同位素簇和确定前体离子、碎片离子及电荷状态时具备高分辨率和质量准确度。通常会将这些设备与低流速色谱在线分离相结合，以获得较高灵敏度，并且能够快速从复杂蛋白质水解物中鉴定出肽段。但是这种在线方法的一个非常大的限制是，只有当肽段正在从色谱柱中洗脱下来时才能得到这一肽段的谱图。也就是说，一旦样品洗脱后进人设备，就不能对肽段进行重复分析，这导致数据获取的时间限制。更糟糕的是,同时洗脱的肽段会抑制相关肽段的电离。除此之外,未修饰肽段及其发生翻译后修饰的肽段通常有着相近的洗脱时间，这导致修饰肤段的信号减弱。

ESI的一种替代方法是基质辅助激光解吸附电离（matrixassistedIaserdesorptionionization，MALDI)。MALDI设备通常使用TOF分析器，但是也可使用其他质量分析仪。这种电离方法使用激光照射样品，样品由分析物(肽段)和紫外线吸收基质组成。基质通常是芳香族酸性组分，能够从激光中吸收能量。基质吸收的能量中一部分转移到分析物中，并共同解吸附到气相，气相中分析物被电离并进人到下游质谱仪进行分析。MALDI既可用于肽段也可应用于整体蛋白质。当应用于后者时,未水解蛋白质上的PTM能够被鉴定。然而，这个方法需要事先了解一些修饰信息，来解释修饰造成的相对未修饰组分的质量漂移。此外,除了比ESI适合分析较大的分析物外,MALDI也利于略
偏碱性肽段的分析(Coveyetal.,1991)。

与ESI在线色谱分离不同，MALDI分析的肽段通常是离线分离。样品可以通过液相色谱法分离，然后点到MALDIjP,盘（MALDItargetplate)中（LochnitandGeyer，2004;Pfliegeretal.，2008;Zhenetal.，2004)。目前有不同的方法可以用来点靶，其中可使用专门设计的自动化机器人。基质材料既可以与样品混合然后点靶,或者在点样品之前或之后直接将基质点到靶盘中。点的大小根据所使用靶盘的规格不同而异，一般从微升到亚微升不等。这个方法的离线特性去除了在线色谱分离的时间限制。这意味着研究者可以利用MALDI盘中的样品完成对同一个靶点的重复测量，直到样品被设备激光耗尽。

MALDI-T0F设备的快速性以及主要产生+1价离子的性质使得该设备成为快速测量肽段和蛋白质质量的便利选择。一个水解的蛋白质样品可以点到MALDI盘中，无需过多处理，短时间内就可得到相关肽段质量谱图。研究者可能从前期研究中了解到样品中存在什么蛋白质，因此对相应的m夂值也会有预期。这些已知的值可以与实验检测到的数值进行比较，得到的任何差异都可以归因于蛋白质上发生的修饰。这个方法简单、快速，并独立于序列算法。对于可疑的磷蛋白，可用碱性磷酸酶处理样品，并与MALDI-TOF联用鉴定磷酸肽(Larsenetal.，2001;Zhangetal.，1998)。磷酸酶处理前后肽图中的差异(80Da)可以帮助鉴定憐酸肽。定位到特定修饰氨基酸通常需要对修饰肽进行串联质谱分析，这时要使用支持MS/MS的仪器（如离子阱、q-TOF、T0F/T0F)。

六、CID、ECD和ETD的对比

基于质谱的蛋白质组学分析依赖于气相中肽段在低碰撞能量下断裂,在质量谱图中形成峰。进而通过峰图确定肽段序列，再推断出相关蛋白质。完成肽段断裂最主要的方法就是碰撞诱导解离（collisioninduceddissociation，CID)(Swaneyetal.，2008)。LTQ、轨道阱(〇rbitraP)、q-TOF、MALDI-TOF/TOF及FT-ICR设备都能完成肽段的CID断裂。CID最适用于小的、低电荷的、未修饰的肽阳离子（p印tidecationKDongreetal.，1996;GoodetaL，2007;Huangetal.，2005)。CID中转移到肤段的碰撞能量造成肤段振动激发，并分布到肽链中的共价键中。如果CID中转移到肽段的内部能量超过了键断裂的活化能垒，肽段便断裂。如果这些碎片在质谱仪的时间尺度内发生，则被检测到。这种断裂通常发生在肽链骨架的酰胺键上，由于这些位点的活化能垒较低，便产生了特征性的b-和y-产物离子,可在CID谱中观察到（Swaneyetal.，2008)。

尽管CID能够有效生成用于肽段测序的一组离子，但是也存在一些限制从而减弱了断裂特定肽段的能力。内部碱性残基和脯氨酸能够阻止肽段骨架的随机质子化。这些残基会将酰胺键的解离转换到特定位点,能够抑制肽段断裂，从而导致测序离子多样性不足(Mikeslietal.，2006)。胰酶作为一种通用蛋白水解酶，通过产生在C端带有碱性残基的肽段而减轻了上述问题。不稳定的PTM,如磷酸化和糖基化也表现出不同的低能量断裂途径。在这些情况下，会发生前面提到的中性丢失事件，导致产生的谱图序列覆盖性不足。一些PTM也会抑制肽段骨架的随机质子化，进而抑制经由CID的断裂(Tsaprailisetal.，1999)。

一种替代的断裂方法称为电子捕获解离（electron-capturedissociation,ECD)，能够克服CID的一些局限。在ECD中，质子化的肽段被FT-ICR的潘宁阱(Penningtrap)保留，并受到一束带有热能或接近热能的电子冲击。质子化肽段捕获热电子后会导致骨架断裂，而分子内振动能并未重新分布（Udeshietal.，2007)。图40.4中描述了一种解释浸人热电子的肽段断裂过程的方式。ECD断裂通常产生c-和Z-离子系列，而CID则产生b-和y-离子。ECD是与分子大小和序列无关的过程，可以用来断裂完整蛋白质。然而，对于有效的ECD，样品必须处于高密度的热电子中。这种环境对于利用静电射频场分离离子的设备，在技术上较难实现,但是在使用静磁场的FT-ICR中比较容易。另外，用于测序的ECD需要在数分钟内进行大量扫描，并取平均值。这需要的样品量较大，且对复杂样品混合物中的蛋白质和多肽的检测不利。

ETD使用多环芳香烃类的离子化自由基负离子，与气相中多质子化肽段反应。这些自由基负离子在质谱的线性四极杆离子阱中储存。自由基负离子转移一个电子到离子化的肽段上，诱发电荷减少的肽段以ECD类似的机制断裂，产生特征性的c-和z-序列离子(Sykaetd.，2004)。ECD和ETD的断裂模式与肽段长度、氨基酸组成和PTM的存在与否均无关(Udeshietal.,2007)。这一断裂过程非常高效,并能在毫秒内完成。因此，ETD的灵敏度高至可测量飞摩尔级的样品量,发生的时间尺度与目前的色谱分离技术一致(SykaetaL，2004)。该断裂技术的主要优势在于,它能够保持不稳定的PTM,同时允许足够的酰胺键断裂，从而产生能够获得测序信息的谱图。然而，这一方法存在由于前体离子电荷减小而导致碎片离子产量降低的问题。

近期一项研究使用了ETD和CID混合方法(ETcaD)，通过CID来靶向ETD未解离的电子转移产物离子。ETcaD的序列覆盖度中位值为88.9%，而单独使用ETD仅为62.5%，CID为77.4%(Swaneyetal.，2007)。其他一些研究利用ETD鉴定PTMJn鱗酸化修饰。一个研究组使用基于CID断裂方法鉴定了1000个以上的磷酸肽,但是仅能鉴定383个磷酸化位点，这主要是由于修饰肽段的中性丢失(Udeshietal.，2007)。使用ETD改良的LTQ,可以鉴定一个复杂混合物中629个蛋白质的1252个磷酸化位点。另一项对ETD和CID鉴定的磷酸肽重叠分析发现，两种方法产生的两个数据集中仅有17.9%相同(Swaneyetal.,2008)。这说明断裂并鉴定PTM位点的最好方法，也许就是将CID和ETD结合起来。图40.5展示了用两种断裂方法产生的典型谱图。在CID中出现了特有的b-和y-离子,而ETD产生了特有的c-和z-离子。

七、PTM的定量分析

当研究PTM的生物学意义时，如能了解一个特定修饰或一组PTM的相对或绝对丰度通常会有帮助。这样可以将不同的生物样品间的目的修饰进行直接比较。例如,将正常与疾病状态下细胞或组织内某一PTM的丰度进行比较。定量分析这些变化能够帮助深人了解PTM在细胞生长、疾病和凋亡等无数过程中扮演的角色。许多方法可以量化PTM，传统方法使用2I>GE和鉴别染色法来鉴定样品中蛋白质表达水平的差异。然而，这个方法分辨率低，并且可能会由于一些蛋白质染色能力的不同而导致产生假象（OngandMann，2005)。2D——GE是最适宜用来分析蛋白质丰度的方法(AndersonandAnder-son,1998)。就在最近,基于质谱的方法减轻了基于凝胶的方法带来的问题。基于质谱的方法包括蛋白质或肽段标记策略、标签手段以及利用谱图计算的差异蛋白质组学法(Gygietal.，1999;OngetaL，2002;Washbumetal.，2001)。尽管这些方法更广泛应用于样品中蛋白质变化的定量分析，但是也可以用来定量分析不同生物样品中PTM的变化。

定量分析既可以是绝对的,如浓度或每个细胞拷贝数，也可以是相对地，如不同处理的样品中倍数变化。绝对浓度更加难以获得，但是更有利于分析，并且可以用来衍生相对测量。LC-MS/MS实验中，随着肽段依次从色谱柱上洗脱下来，可绘制肽段信号强度图谱。对于任何给定的组分，曲线下的面积都与肽段的丰度直接相关，可以进行无标记(label-free)的量化。然而，肽段的理化性质，如疏水性、电荷和大小,变化范围非常广,这会引起质谱检测器响应的差异。另外，当采用这种无标记方法进行定量分析时，洗脱条件的变化及其他非目的肽段的共同洗脱都会成为问题。使用这个方法测定蛋白质丰度可能与实际丰度相差3〜5倍(OngandMann,2005)。

为避免电离效率和MS-检测器响应相关的问题，可以利用基于稳定同位素稀释理论(stableisotopedilutiontheory)的方法。这一理论认为，一个稳定的、同位素标记的肽段与其天然类似物化学性质相同。因此，同位素标记和未标记的肽段,在色谱和MS检测中行为一致。由于质谱能够识别标记和未标记形式间的质量差异，因此可以检测相对的信号强(Bantscheffetal.，2007)。利用稳定同位素稀释理论的策略主要有4种。第一，与目的PTM相应的同位素标记肽段标准物可以引入到样品中（Gerberetal,,2003)。第二，细胞在含主要同位素化纯组分的培养基中生长，可以被代谢标记(OngandMann,2005)。第三，在使用蛋白酶，如胰酶水解过程中，同位素可以被整合到肽段中（MiyagiandRao,2007)。第四，可以通过化学方法将同位素标记的标签连接到特定氨基酸侧链上(Gygietal.，1999;Rossetal.，20〇4)。不管选择什么方法，肽段的「重」「轻」形式之间质量差异应最小为3〜4Da,以避免质谱图中峰的同位素重叠。另外，氣化肽段与其「轻」的类似物相比，色谱洗脱时间有所不同（ZhangandRegnier，2002)。这导致需使用更加昂贵的13C-和15N-试剂。

运用稳定同位素的最基本的方法称为绝对定量法（absolutequantitation，AQUA)(Gerberetal.，2003)。在这一方法中，将合成的同位素标记肽段作为内标加人到肽段混合物中。SteveGygi和同事利用这个方法确定了非洲爪蟾(Xenopws)细胞周期中磷酸化的丰度变化(Stemmannetal.，2001)。这个方法需要为每个量化的PTM标记合成肽段，因此比较麻烦。标记的磷酸肽内标物易于获得，但并不是所有的修饰都这么简单，这限制了这个方法的广泛应用。内标物通常在蛋白质水解的前后加入,这样无法标准化消化步骤上游的样品制备时出现的变化。这一方法还需要对PTM有事先了解，从而能够合成相应肽段。也有必要了解修饰肽段的大体丰度，从而能够加人近似量的标记标准物。

为最小化样品制备的误差，细胞可以在不同条件(含同位素标记或不含同位素标记）下培养，并且在样品制备和分析之前收集细胞。样品制备时的任何误差都会对两种细胞群产生同样的影响。MathiasMann的实验室发展了这些方法中最流行的技术，称为细胞培养氨基酸稳定同位素标记（stableisotopelabelingbyaminoacidincellculture,SILAC)(Ongetal.,2002)。在SILAC方法中，培养基中含13C6-精氨酸和13Cs-赖氨酸，它们能够标记胰酶酶切位点。因此除去C端碎片，每个胰蛋白酶酶切产物都包含一个标记的氨基酸。SILAC法与完全代谢标记法相比优点在于,整合的标记数是确定的，并且独立于氨基酸序列。这种简易性使得SILAC的数据翻译比使用其他更复杂的标记方法简单。SILAC最多只能比较3个培养条件，分别是未标记、13C,-标记或13C615N4-标记氨基酸。SILAC的其他局限性在于它只能用于特定的模式生物，或者是能够在含有确定同位素成分的培养基中生长的细胞系，并且非常昂贵。然而SILAC的高准确度使得该方法非常适合于研究PTM(G)Isenetal.，2006)。一个改进的SILAC法利用标记的S-腺苷甲硫氨酸进行标记，来鉴定并相对定量蛋白质甲基化修饰(()ngetal.，2004)。

一种体内代谢标记法的替代方法是体外酶标记法。这种标记方法既可以在蛋白质消化过程中完成，也可以在蛋白质水解后通过额外反应步骤完成。当使用重水（H218O)时，胰蛋白酶或Glu-C将会引入两个18O原子。生成的4Da漂移足以使同位素被分辨，并获得相对定量数据(MiyagiandRao，2007)。然而，一些蛋白酶，如蛋白内切酶LytN，仅引入一个18O原子，产生的谱不足以分辨同位素峰重叠(Raoetal.,2005)。完全酶标记很难达到，并且不同肽段引人标记的速率不同，使得数据分析变得复杂(Ramos-Femandezetal.，2007)。所以此方法在定量蛋白质组学中没有得到广泛应用(Ongetal.，2004)。

有效的化学标签（chemicaltagging)技术能减轻酶标签方法的某些限制。最早的化学标签法是由RuediAebersold实验室发展的，称为同位素编码亲和标签（isotope-codedaffinitytag,ICAT)(Gyg丨etaL，1999)sICAT试剂最初由以下成分组成:一个靶向半胱氨酸的硫醇反应基团、带有〇或8个氣原子的一个聚醚连接区(linkerregion)以及为亲和素柱亲和纯化准备的生物素基团。由于氘同位素与其轻形式相比在色谱柱中的行为不同，因此发展了13C和15N附加标签试剂(Bottarietal.，2004)。ICAT反应在还原环境下进行，利用重或轻ICAT试剂将样品化学标记。然后，这两个样品混合，并选择一种蛋白酶将其水解。标记的肽段通过ICAT组分的亲和标签回收,并用质谱定量分析。这一方法仅选择含有半胱氨酸的肽段，因此有效简化了肽段混合物。然而大部分肽段不含半胱氨酸残基，并且大部分PTM在亲和纯化步骤中被丢弃，因此ICAT并没有广泛应用于PTM定量分析(Bottarietal.，2004)。

另外一类化学标签策略是利用肽段N端和赖氨酸残基的e•氨基的反应活性。同位素编码蛋白标记法(ICPL)、相对和绝对定量同位素标签法（isot0petagforrelativeandabsolutequantification，iTRAQ)及串联质量标签法（tandemmasstag，TMT)都是利用了氨基与特定化学基团的反应活性(Bottarietal.，2004)。这些方法中最受公认的技术为iTRAQ,其引人了等量异位（isobarictag)标签,能够在串联质谱仪中断裂，在113〜121m/z值处产生了独特的报告离子(Ongetal,,2004)。通过对这些低质量碎片的峰面积进行积分来定量。具备检测低m/z碎片离子能力的质谱仪，如四极杆和TOF,通常都可用于iTRAQ实验。商业化试剂盒允许一个实验检测8种状态。由于肽段的标记是等量的，因此它们在色谱分离中性质类似，并且在碎片图谱中显示出定量差异。通过iTRAQ方法，不同样品在不同条件下分离，经胰酶消化后，利用iTRAQ试剂进行标记。随后样品混合，并通过一个MS/MS实验进行分析。图40.6展示了一个经4种iTRAQ试剂标记后，按不问比例混合而得到的串联质谱图的例子(Rossetal.，2004)。至于其他基于质谱的方法，有效的肽段分离非常重要，因为共同洗脱下来的相近质量的肽段也会对观测到的报告离子作出贡献，从而干扰定量分析。离子阱质谱法通常不适用于iTRAQ分析，因为得到的MS/MS数据中，iTRAQ标签碎片产生的报告离子中的较小的1/3会丢失。利用脉冲q解离(pulsedq-dissociation，PQD)可缓解该问题，但是后者在蛋白质组学中应用有限（Bantscheffetal.，2008;Cunninghametal.，2006;Griffinetal.，2007)。

利用iTRAQ方法可以比较不同条件下蛋白质组的磷酸化水平。ForestWhite和同事研究利用抗磷酸化抗体后接IMAC富集，进而iTRAQ标记的方法研究表皮生长因子(EGF)刺激随着时间对细胞磷酸化状态的影响（Zhangetal.，2005)。这项研究在一次分析中调査了4个时间点(0min、5min、10min、30mim)。他们能够量化58个蛋白质的78个位点的磷酸化相对变化(Zhangetal.,2005)。这项实验方法强调了将PTM富集与定量相结合的功效，能够更加深入地了解细胞的生物学。但是很难确定在某一特定条件下一组肽段中哪些发生了磷酸化，这是因为未磷酸化肽段与磷酸化肽段在质谱检测响应中有差异。因此,尽管可以在不同条件下，将未修饰形式之间进行比较，或者将相同肽段的不同磷酸化水平进行比较，但是通过生成谱的报告离子峰的比值来比较修饰与未修饰形式并不可靠。

目前发展了有限数量的专门鉴定特定FTM的附加标签的方法。这些方法利用了化学修饰的氨基酸侧链选择性的化学反应。为了定量分析磷酸化修饰,磷酸的消除以及随后的乙二硫醇衍生物的Michael加成都可用来引人同位素标签(ZhangetaL，2003)。阱化学法也可应用于糖基化的肽段,用同位素标记的标签替换碳水化合物基团。但这些方法仅对少数PTM有效。除此之外，如果参与的化学反应并不高效，生成的多肽混合物的复杂程度将会增加。这会导致肽段和相应PTM的鉴定出现问题,也会出现不准确的量化信息。

同位素标记和标签策略可能耗时、繁琐并且成本较高。除了先前讨论的色谱峰积分法，也有其他一些无标记定量方法可以用来定量分析PTM。这些方法通常会涉及一些形式的谱图计数(spectralcounting)和蛋白质长度的标准化（Washburnetal.，2001)。它们是否真正能够进行定量分析仍存在争议,因此这些方法更普遍作为差异蛋白质组学技术。谱图计数方法的理论基础是，随着给定样品中某一蛋白质丰度的增加,能分离出更多来源于该蛋白质的肽段MS/MS谱。通过比较实验组间收集的某一特定蛋白质的谱图的数量可推断出相对的定量分析。这一方法的使用被质疑是由于它并没有直接测量肽段的任何物理性质，并且假定每个蛋白质都发生线性反应(BantscheffetaU2007)。正如前面提到的，肽段的理化性质在一个消化样品中变化范围非常广，以至于它们在色谱和MS检测器的行为也大有不同。与标记和标签技术相比，这些方法提供了更大的动态范围，最适用于研究样品中大的或球状蛋白质的变化。然而，肽段中不确定线性反应和谱图计数的潜在低准确度都限制了这些方法的广泛应用(Oldetal.，2005)。

为了将样品中蛋白质无标记定量分析的变异性最小化,可以比较多个样品中相同蛋白质的特定肽段或多种肽段。这推动/选择性反应监测（selectedreactionmonitoring，SRM)和PTM的多重反应监测(multiplereactionmonitoring,MRM)技术的发展(Unwinetal.，2005，2009;WilliamsonetaL，2006;Wolf-Yadlinetal.，2007)。在一个SRM实验中，多个实验组中的单一肽段前体及其碎片离子m八值或瞬态(transition)被选择性监测，通常使用三重四极杆质谱(Langeetal.，2008)。要使蛋白质的量化具有较高的统计置信度，通常在MRM实验中检测3〜5肽段及其瞬态。这些实验一般使用三重四极杆质谱，因四极杆的第一个和第三个四极杆在分离特定的瞬态时具有高分辨率和高占空比(highdutycycle)。多重瞬态被监测,随着时间每个特定瞬态都产生一组关于滞留时间和信号强度的谱图。瞬态的积分区域用来定量分析蛋白质。MRM能够实现对复杂混合物中低丰度蛋白质的检测，并在高达5个数量级的动态范围内产生线性响应(Langeetal.，2008)。

虽然MRM可以用来选择性监测包含PTM的蛋白质(Williamsonetal.，2006)，然而，MRM缺少鉴定混合物中蛋白质的能力，并且瞬态的选择通常是基于先前的实验数据或文献搜索。瞬态还必须进行优化,以便能在三重四极杆中的第二个发生有效断裂。尽管计算工具可能会有所帮助,但是研究还是可能因样品有限而受到限制。另外，三重四极杆利用CID断裂肽段，因此不稳定PTM可能会发生中性丢失。

MRM的扩展应用包括使用同位素标记的合成肽(过程类似于AQUA)来完成肽段绝对定量分析(Wolf-Yadlinetal.,2007)。总之,这种质谱中新出现的技术非常有潜力，能够为多种生物样品提供蛋白质和PTM的定量分析信息。